光遗传学是什么 一文看懂光遗传学基本概念

光遗传学是一项结合光学与遗传学手段，能够精准操控特定神经元活动的技术。该技术最早由米森伯克于2002年实现，随后在2005年由迪塞罗斯和博伊登进一步优化，显著推动了对大脑功能的认识。其基本原理是通过基因操作，将外源光敏感蛋白基因导入活细胞，使光敏感通道蛋白在细胞膜上表达。随后，利用特定波长的光照，激活或关闭这些通道蛋白，从而控制离子通道的开关，引致细胞膜电压发生变化，例如去极化或超极化。当膜电压去极化达到一定阈值时，会触发神经元产生可传导的电信号，即神经元被激活；反之，若膜电压超极化至一定程度，则会抑制神经元动作电位的产生，即神经元被抑制。

与传统的电生理激活多种神经元且具备高时间分辨率的方法相比，光遗传学技术能够以无损伤或低损伤的方式，控制特定神经元的活动，用于研究神经网络功能，尤其适合在体甚至清醒动物行为学实验，具备高时空分辨率、高特异性以及轴突投射选择性（见图1）。

图1. 光遗传学与电生理调控细胞的差异

一、光遗传学技术的原理

光遗传学技术对细胞活性的调控依赖于光敏感通道蛋白的类型，包括兴奋性和抑制性光敏感通道。若细胞中转入的是ChR通道，在蓝光照射下通道开放，阳离子大量内流，产生去极化并诱发动作电位，从而激活细胞。若转入的是HR通道，在黄光照射下通道开放，阴离子大量内流，导致超极化，使动作电位不易产生，从而抑制细胞活性。此外，还存在一类光激活或抑制的通道optoXR，经过一定频率的光激活后，会改变细胞内激酶系统，进而影响细胞活动（见图2）。

图2. 光遗传学技术调控细胞活性的类型

二、三种常用光遗传学技术

1. 光遗传电生理

实验步骤（见图3）：

1）根据实验设计需要，选择合适的光敏感通道蛋白；

2）将光敏感通道插入病毒载体并感染细胞，使光敏感通道蛋白在特定类型的细胞中表达；

3）将光纤埋植在实验动物脑中；

4）根据病毒表达时间，通过特定频率的激光调控光敏感通道的开启；

5）通过电生理记录实验结果。

应用：活体环路功能验证。

图3. 光遗传学的实验步骤

2. 光遗传膜片钳（上游光遗传结合下游膜片钳）

实验步骤：

1）根据实验需要选取适当周龄（一般6-7周）小鼠，在上游脑区A立体定位注射携带光敏蛋白的AAV（病毒体积需根据病毒滴度和核团大小等调整）。

2）待病毒表达2-3周后，取小鼠断头取脑，震荡切片，片厚300μm（目标脑区A）。

3）选取被AAV荧光标记且状态良好的细胞进行记录，用单个和不同频率激光刺激目标脑区A，观察记录细胞的响应情况。如有响应，确定病毒工作且细胞状态良好，可进一步确定后续实验所需刺激频率；如无响应，需先判断细胞状态，如细胞状态好，可通过增加刺激强度判断病毒是否工作。确定脑区A中被标记细胞对光刺激有响应后，可进行后续实验。

4）待病毒表达至少3周后，小鼠断头取脑，震荡切片，片厚300μm（目标脑区B）。

5）选取脑区B中被AAV荧光标记的神经纤维附近状态良好的细胞进行记录，用光刺激目标脑区B，观察记录细胞的响应情况。如有响应，观察细胞响应与光刺激之间的时间间隔，判断是否为单突触联系；如无响应，需先判断细胞状态，如细胞状态好，可通过增加刺激强度再记录。确定脑区B的细胞对光刺激有响应后，可进行后续实验。

6）通过向记录槽中加入不同受体的激动剂或拮抗剂等，可进一步确定突触连接的类型。

7）换取同一脑区上不同细胞、不同脑片重复进行上述步骤5和6，获取一定数量的数据后分析整理、作图。

应用：离体环路功能验证；判断两个脑区（上游脑区A和下游脑区B）之间是否存在功能联系。

3. 光遗传行为学

实验步骤

1）寻找合适的充当报告基因的视蛋白，包括BR、HR、ChR、CoChR等；

2）向受体细胞输送光敏感蛋白，完成转染和表达；

3）选择合适光源进行调控，通过改变光照波长和光脉冲强度精准调控细胞、组织和器官的相应生物学反应；

4）观察光刺激后动物行为并评估效应。

应用：动物行为学研究（包括进食行为、奖赏行为、焦虑抑郁行为、痛行为等）。

常见光敏通道蛋白及特点

三、光遗传学技术优势

1. 时间精确度高：光遗传技术可以通过控制激光使时间精准度到毫秒级别甚至是亚毫秒级；

2. 刺激的强度精确性高：光遗传技术通过控制激光，可以精准地、随时地调节给神经元刺激的强度，这对于某些刺激强度依赖的神经环路研究有不可替代的优势；

3. 空间特异性：光遗传学技术可以通过脑定位注射、特异性启动子、甚至是亚细胞器定位肽，将光敏感蛋白锚定在靶向细胞或细胞器进行操作，可达到单个细胞的级别，实现精准定位；

4. 作用工具多样：目前人们已经突变了一系列新的光敏感通道，这些通道的时间特性和激发光要求都不同，可根据具体的实验需求进行选择；

5. 作用直接：不像DREADDs技术依赖于动物代谢水平，光遗传学技术通过激光操控细胞的激活或抑制，作用直接。

目前，科学家已找到可用于控制细胞行为的光敏蛋白，并开发出具有各种功能的检测工具，同时，随着光传导技术的发展，使得对生物研究的演示（不论是其体内还是体外）的控制程度达到了前所未有的水平。两者并驾齐驱，让科学家们利用光遗传学在生命科学领域取得了空前的成就。